在NextSeq500/550 和MiniSeq测序系统上对混合文库进行index测序时，非常重要的一点是要选择合适的index组合，否则可能会因为在读index时簇定位失败而导致index测序失败。本篇bulletin将针对NextSeq 和MiniSeq系统提供样本混合方针。

双通道测序

NextSeq 500/550和MiniSeq 测序系统只需要2张图片就可以区分4种碱基：一张图片来自红光通道，另一张图片来自绿光通道。不同于每种碱基各带一种单独的荧光标记的四通道测序，双通道测序使用两种荧光染料，C碱基标记红色，T碱基标记绿色，A碱基同时标记红色和绿色，G碱基没有荧光标记。

图1：双通道SBS荧光成像（假彩色图片仅是效果图）。为了提高4种DNA碱基的检测速度，MiniSeq和NextSeq500/550只用了2个图像分别捕捉红色和绿色波段的信号。仅在红色或绿色图像检测到的cluster分别被转译为C和T碱基。同时在红色图像和绿色图像被检测到的cluster被转译为A碱基，在两张图片中都没有检测到信号的cluster将被认为是G碱基。

Index的考量

• Index reads中前两个循环必须至少有一个碱基不是G。如果index read前面两个碱基都是G，就会由于没有荧光信号导致cluster定位失败，所以Index的前两个循环中必须有一个碱基有信号才能确保index的正常拆分。
• 选择index进行组合时，每个循环都至少有一个通道有信号，最好是两个通道都有信号。
  • 红色通道对应A或者C碱基
  • 绿色通道对应A或者T碱基

这样碱基读取的过程才能确保数据分析的精确。

Index组合的例子：

理想的index组合：每个循环需要两个通道都有信号。

可接受的index组合：只有一个通道有信号，但是仍然有足够的信号进行测序。

不好的index组合：index read前两个碱基都是G，没有信号产生，导致cluster定位失败。

✔= 两个通道均有信号。注意，A碱基在红色和绿色两个通道中均有荧光。
✔= 只一个通道有信号，可接受的组合。
✖= 两个通道中均没有信号。

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