Atteindre une densité de cluster optimale est essentiel pour un séquençage de haute qualité sur les systèmes MiniSeq, MiSeq, NextSeq 500/550 et HiSeq 2500. Sur les Flow Cell à clusturisation libre (pas comme l’Iseq, NovaSeq ou le HiSeq 3000/4000), la densité de cluster a un impact significatif sur les performances du run, en particulier la qualité et la quantité totale des données. Bien que le sous-clustering puisse maintenir une haute qualité des données, il en résulte une quantité de données inférieure. Alternativement, le sur-clustering peut conduire à l'échec du run, de mauvaises performances du run, des scores Q30 inférieurs, l'introduction d'artefacts de séquençage et à une quantité de données inférieure. Ce bulletin résume les ressources et les meilleures pratiques pour éviter le sous-clustering et le sur-clustering, et pour obtenir des densités de cluster plus constantes.
- Le contrôle de la qualité et la quantification précise des librairies sont essentiels. Si ceci n'est pas effectué, c'est la cause la plus courante de problèmes de clusterisation. Suivez toujours les méthodes mentionnées dans le bulletin suivant: Library Quantification and Quality Control Quick Reference Guide
- Suivez les dernières directives spécifiques aux instruments pour diluer et dénaturer les librairies:
- Meilleures pratiques pour la dénaturation des librairies:
- La solution stock de NaOH 2N doit avoir un pH > 12,5 avant toute dilution. Vérifier le pH de la solution stock avant de diluer.
- Préparez toujours du NaOH fraîchement dilué pour dénaturer les bibliothèques au moment de l'utilisation.
- Pour éviter que des erreurs de micro-pipetage n'affectent la concentration finale de NaOH, préparez au moins 1 ml de NaOH fraîchement dilué.
- Pour de meilleurs résultats, décongelez toujours les réactifs de séquençage avant de dénaturer et de diluer les librairies. Pour plus d'instructions, consultez le guide système (System Guide) de votre instrument
- Suivez le guide des bibliothèques de dénaturation et de dilution pour votre instrument.
- Pour l’HiSeq 2500 et le MiSeq, il est important que la solution finale de NaOH ne dépasse pas 1 mM après dilution avec HT1. Plus de 1 mM de NaOH inhibe l'efficacité d'hybridation.
- Lors de la dénaturation des librairies pour NextSeq 500/550 et MiniSeq, utilisez 200 mM de Tris-HCl pH 7,0 pour assurer que le NaOH est complètement hydrolysé dans la solution finale. Par conséquence, l'hybridation n'est pas affectée même lorsque la concentration finale de NaOH est supérieure à 1 mM (voir ci-dessus les guides de dénaturation et de dilution NextSeq 500/550 et MiniSeq).
- Pour les librairies à structures complexe ou riches en GC, la constance de la densité de cluster s'améliore lorsque la librairie est dénaturée par la chaleur avant de charger le pool sur l'instrument. Cette méthode est facultative pour les autres librairies.
- Après la dénaturation par NaOH et dilution en HT1 de la librairie jusqu’à atteindre la concentration de charge finale, incuber la librairie diluée à 96°C pendant 2 minutes (utilisant un bloc thermique).
- Après l'incubation à température, inverser le tube 1 à 2 fois pour mélanger.
- Déplacez rapidement la librairie dans un bain d'eau glacée pendant 5 minutes. L'étape de refroidissement rapide permet de verrouiller la bibliothèque dans sa forme simple brin.
- Procéder immédiatement à la génération du clusters.
- Considérez la taille moyenne de votre bibliothèque. Ceci est important puisque le processus de clustering amplifie préférentiellement des fragments plus courts, les grands ont tendance à se clusturiser moins efficacement. La tech note Nextera Library Validation and Cluster Density Optimization répertorie des directives pour les concentrations de chargement en fonction de la taille moyenne de la librairie.
- Une attention particulière est nécessaire lors du séquençage des librairies à basse diversité (low-diversity libraries) pour garantir une densité de cluster consistante et une bonne qualité des données. Pour les directives de séquençage de librairies à faible diversité, reportez-vous à la tech note de l'instrument approprié: MiSeq, HiSeq, NextSeq, and MiniSeq.