このリソースでは、Ion Torrentからイルミナの次世代シーケンスプラットフォームへの移行プロセスに関する段階的なガイダンスを提供します。
フィールドアプリケーションサイエンティスト（FAS）によるオンサイト設置トレーニングは、iSeq 100システムを除くすべてのベンチトップシステムの購入に含まれています。これらのトレーニングでは、実験デザイン、装置の操作、ベストプラクティス、トラブルシューティングについて学びます。他にもいくつかのトレーニングオプションがあります。
Ion PGMには、不要になった付属品があります。イルミナのベンチトップシーケンス消耗品は、個別のフローセルを備えたシングルカートリッジベースです。
AmpliSeq for Illuminaライブラリー調製に必要な機器は、Ion TorrentでAmpliSeqライブラリー実験を行うために必要な機器と同じです。
必要な消耗品と装置の一覧については、AmpliSeq for Illumina Custom PanelsおよびCommunity Panels Consumables & Equipmentを参照してください。
シーケンスコストは、システム、スループット、ランあたりのサンプル数によって異なります。サポートが必要な場合は、地域のアカウントマネージャーにお問い合わせください。
イルミナシーケンスシステムの比較については、Sequencing Platform Comparison Toolを参照してください。この決定についてさらにサポートが必要な場合は、イルミナのテクニカルサポートまたはお近くのイルミナ代理店にお問い合わせください。
すべてのイルミナシステムでは、AmpliSeq for Illuminaを実行できます。しかし、サンプルごとの出力要件により、ベンチトップシステムが最も適しています。実験ニーズに最適なガイダンスについては、AmpliSeq for Illuminaのチラシを参照してください。
ペアエンドシーケンスでは、断片の両端をシーケンスし、アライメント可能なシーケンスデータを生成できます。ペアエンドシーケンスは、ゲノム再構成や反復配列要素、遺伝子融合や新規転写産物の検出を容易にします。詳細については、ペアエンドシーケンスとシングルリードシーケンスを参照してください。
クオリティスコアはイルミナシステム上でQ30で測定されます。解析はLocal Run ManagerまたはBaseSpace Sequence Hubを用いて行います。
AmpliSeq for Illuminaパネルの性能に関する情報は、AmpliSeq for Illumina製品ページの各ページに記載されているデータシートを参照してください。
Thermo Fisher Ion AmpliSeqの入力と同じサンプル品質をAmpliSeq for Illuminaで使用できます。
全体として、装置のセットアップと調製に必要な時間により、イルミナシステムのワークフローが迅速になります。詳細については、該当する製品マニュアルを参照してください。
| ステップ | 時間 |
|---|---|
| AmpliSeq for Illuminaライブラリー調製 | 5～7時間 （サンプル番号やパネルによって異なる場合があります） |
| シーケンス | 17～56時間 （プラットフォームおよびラン長による） |
| 解析 | 1～2時間 （Local Run ManagerまたはBaseSpace Sequence Hubを使用） |
イルミナのプロトコールでは、プロトコールの最後に2回目の7サイクルPCRステップがあり、Thermo Fisher Ion AmpliSeqプロトコールと比較して追加のビーズクリーンアップがあります。この差により、AmpliSeq for Illuminaライブラリー調製に合計約45～60分かかります（上記の推定値に含まれています）。
デスクトップシステムは、システムと融解方法によって融解時間が異なるカートリッジベースの試薬を使用します。融解および安定性に関する完全な情報については、最適な性能を得るためにシーケンス試薬を融解および保管する方法を参照してください。
初期入力要件はIon AmpliSeqプロトコルと同じです。
Ion AmpliSeqプロトコールとAmpliSeq for Illuminaプロトコールには、増幅やクリーンアップステップの追加など、いくつかの重要な違いがあります。AmpliSeq for Illuminaプロトコールを成功させるには、AmpliSeq for Illumina Custom and Community Panels Reference Guide の指示を確認し、それに従ってください。
AmpliSeq for Illuminaライブラリーは、以下を使用して定量化できます。
BaseSpace Sequence HubやLocal Run Managerなどのイルミナの解析オプションで使用されるマニフェスト形式は、Thermo Fisher Ion Reporterソフトウェアで使用される形式とは異なります。固定パネルのマニフェストはイルミナテクニカルサポートから入手できます。
ランごとにプールできるサンプル数は、パネルサイズとシーケンスシステムにより大きく異なります。装置ごとの推奨サンプル番号については、各パネルの文書サポートページを参照してください。
ペアエンドリードはリファレンスにアライメントされる可能性が高いため、データセット全体の品質が向上します。イルミナの次世代シーケンスシステムはすべてペアエンドシーケンスが可能です。
すぐに使えるパネル、カスタムパネル、コミュニティパネル、およびオンデマンドパネルは、MyIlluminaから注文できます。
カスタムパネルまたはコミュニティパネルの注文後、配送時間は3～4週間です。
イルミナコンシェルジュがどのようにリソースになるか、営業担当者にご相談ください。イルミナコンシェルジュはThermo Fisher White Glove Serviceに似ています。パネルのアンプリコンサイズに基づいて適切なシーケンス消耗品を注文してください。
クラスター密度は、Ion Torrentのサポート文書でローディング密度と呼ばれます。イルミナの装置でクラスター密度を最適化する方法のガイダンスについては、以下の資料を参照してください。
Ion AmpliSeqカスタムパネルは、AmpliSeq for Illumina Library PLUSキットと技術的に連携できますが、イルミナは、イルミナから最適なサポートを得るためにDesignStudioを通じてカスタムパネルを注文することを推奨しています。
シーケンス中およびシーケンス後に利用できる一次品質メトリクスが多数あります。ランを評価する際にどの品質メトリクスが最適に適用されるかに関するガイダンスについては、トレーニングウェビナーのシーケンス解析ビューアー101：それは何を意味しますか？
Sequencing Analysis Viewer（SAV）は、ランメトリクスのダッシュボードをすばやく表示するために装置上または装置外にインストールできます。詳細については、Sequencing Analysis Viewer Software GuideのSummary Tabセクションを参照してください。
ウェブベースのトレーニングは、さらなる解析の前にランの品質を確認する方法を説明するベンチトップシーケンスプラットフォームで利用できます。
イルミナのベンチトップシーケンスプラットフォームはWindows上で実行されます。主に装置制御ソフトウェアを使用してシステムを操作します。ユーザーインターフェースはWindowsユーザーにとって使い慣れたものです。
140～275 bpのアンプリコンサイズには、2 × 151 bpのペアエンドランが推奨されます。375 bpアンプリコンサイズでは、MiSeqシステム最大2 × 301 bpのペアエンドランを推奨します。
このキットには、シーケンスランごとに最大96のサンプルのプーリングを可能にする統合サンプルバーコードがあります。シーケンスランごとに一緒にプールできる実際のサンプル数は、アンプリコン数とシーケンスカバレッジの望ましい深度によって異なります。これらの計算に役立つオンライン計算機が利用できます。
Local Run Managerは、イルミナのベンチトップシーケンスデータ用のWindowsベースのソフトウェアです。ローカル解析オプション、ランおよびユーザー管理が含まれます。Local Run Managerウェビナーでは、Local Run Managerの概要を説明し、新規および中間ユーザーを対象としています。詳細については、Local Run ManagerサポートページおよびLocal Run Managerの概要トレーニングコースを参照してください。
Local Run Manager装置およびコンピューティング要件は、Local Run Managerソフトウェアガイドのインストールセクションで入手できます。
Local Run Managerのセットアップについては、シーケンスファイルフォーマット、データ解析用FASTQ処理ツールウェビナー、Local Run Manager導入ウェビナーを参照してください。
BaseSpace Sequence Hubは、イルミナのクラウドベースのシーケンスデータ解析ソリューションです。ランとプロジェクトの違い、データの取り扱い、データの共有などの情報については、BaseSpace Sequence Hubウェビナーを参照してください。詳細については、BaseSpace Sequence HubサポートページおよびBaseSpace Sequence Hubによるランの準備トレーニングコースを参照してください。
ランが進行すると、コントロールソフトウェアは、データ解析のためにベースコールファイル（*.bcl）を指定した出力場所に自動的に転送します。データ解析の方法は、アプリケーションとシステム構成によって異なります。シーケンスデータをBaseSpace Sequence Hubにストリームすると、自動的にFASTQに変換されます。詳細については、シーケンスファイルフォーマットを参照してください。