このリソースは、TruSeq Custom AmpliconからAmpliSeq for Illuminaへの移行プロセスに関する段階的なガイダンスを提供します。
DesignStudioを使用して、AmpliSeq for IlluminaパネルとしてTruSeq Custom Ampliconパネルを再現できます。パネルがLibrary PlusキットおよびAmpliSeq for Illuminaインデックスキットと共に設計および注文されると、パネルはバリデーションランの準備が整います。
DesignStudioには、カスタムパネル設計プロセスを進めるためのツールチップとオンラインヘルプが組み込まれています。AmpliSeq for Illumina Custom and Community Panelsサポートページには、ライブラリー調製ユーザーガイド、トレーニングビデオなどの有用な情報が含まれています。さらにサポートが必要な場合は、イルミナテクニカルサポートまたはフィールドアプリケーションサイエンティストにお問い合わせください。
DesignStudioでパネルデザインが完了した後、%のin silicoカバレッジが提供されます。カバレッジ性能の実際の経験的均一性（平均の>0.2倍の割合）は、in silicoカバレッジの数パーセントポイント以内になります。カバレッジの最適化に関するサポートについては、現地のフィールド担当者に連絡してコンシェルジュにお問い合わせください。
AmpliSeq for IlluminaはFFPEから抽出されたDNAと互換性があります。このテクノロジーは、1 ngという低インプットサンプルが可能です。
一般的に、シトシンの脱アミノ化によって導入される偽陽性バリアントコール率は極めて低く、AmpliSeq for Illuminaアッセイでは非常に低い頻度（<1%）です。脱アミノ化が大きな懸念事項である場合、UDG酵素製造業者のプロトコールの推奨に従って、FFPE抽出DNAのUDG前処理を行うことができます。
DesignStudioは、信頼性の高いアンプリコンデザインを返品します。各設計はユニークで、サンプルインプットは異なるため、設計の性能は経験的にテストする必要があります。In silicoデザインカバレッジは、実際のパネル性能の優れた予測因子です。
これらのパネルは、iSeq 100、MiniSeq、MiSeq、またはNextSeqシリーズシステムでの実行に最適です。
TruSeq Custom Amplicon Low InputおよびTruSeq Custom Amplicon v1.5に推奨されるサーマルサイクラーは、AmpliSeq for Illuminaには推奨されません。消耗品と装置リストのサーマルサイクラー、互換性のあるプレート、および磁石の推奨リストを参照してください。
AmpliSeq for Illuminaには、TruSeq Custom Ampliconキットとは異なる試薬キットとインデックスが必要です。必要なコンポーネントの全リストについては、消耗品および機器リストを参照してください。TruSeq Custom Ampliconの要件に関連する以下の違いに注意してください。
以下は別途注文する必要があります。
AMPureビーズを購入する必要があります。
注文プロセスはTruSeq Custom Ampliconと同じです。MyIlluminaで注文します。
再注文にはカスタムパネルの新しい合成が必要で、DesignStudioまたはMyIlluminaから注文できます。初回オーダーと再オーダーの違いは、デザインがすでに作成されていることです。再注文と新しいカスタムパネル注文の間でリードタイムに違いはありません。
ユーザーガイドに示されているプロトコール修正を使用した低品質の入力は成功しています。市販またはラボで検証されたDNA抽出法は、通常、AmpliSeq for Illuminaアッセイと互換性のあるDNAを生成します。
TruSeq Custom AmpliconプロジェクトはDesignStudioで再設計する必要があります。TruSeq Custom Ampliconから*.bedファイルにデザインをエクスポートし、AmpliSeq for Illuminaデザインインプットとしてアップロードすることができます。手順については、DesignStudioオンラインヘルプを参照してください。
パネルを作成する際には、パネルが提供する全体的なカバレッジを評価することが重要です。対象領域が成功したファイルと、設計上のギャップを含むファイルが、カバレッジのない領域のレビューと特定に利用できるようになります。DesignStudioでは、購入を約束することなくパネルを設計できます。
DesignStudioは、パネル設計全体のカバレッジ計算を提供します。また、ギャップファイルをダウンロードして、カバレッジのない領域を特定することもできます。AmpliSeq for Illuminaパネルデザインツールへのアクセスは、イルミナのウェブサイトから入手できます。
推奨入力量はプールあたり10 ngです。許容範囲はプールあたり1～100 ngです。
AmpliSeq for Illuminaは、FFPEサンプルから抽出された低品質のDNAで機能します。低品質サンプルの場合、またはサンプル品質が不明な場合は、増幅ターゲットステップでさらに3回のPCRサイクルを推奨します。AmpliSeq for Illumina Custom and Community PanelsリファレンスガイドのAmplify DNA Targetsセクションにある、温度サイクラープログラムの調整の表を参照してください。
AmpliSeq for Illuminaの総ライブラリー調製時間は5～7時間です。ハンズオン時間は<1.5時間で、ライブラリーの定量化、ノーマライゼーション、プーリングは含まれません。
AmpliSeq for Illuminaプロトコールで使用されるインデックスアダプターは、AmpliSeq for Illumina専用に設計されています。アダプターには独自の設計と修正があります。NexteraまたはTruSeqアダプターはこのプロトコールに対応していません。
アダプターシーケンスについては、イルミナアダプターシーケンスドキュメントのAmpliSeq for Illumina Panelsセクションを、インデックスアダプタープーリングガイドのAmpliSeq for Illuminaプーリングガイドラインセクションを参照してください。
AmpliSeq for Illuminaライブラリーは、プーリング前にノーマライズしてから、最適なローディング濃度に希釈する必要があります。ガイダンスについては、AmpliSeq for Illumina Custom and Community Panels Reference Guideを参照してください。
イルミナのExperiment Manager（IEM）を使用することもできます。IEMは以前のTruSeq Custom Ampliconワークフローでも機能します。BaseSpace Sequence Hub PrepタブとLocal Run ManagerにはAmpliSeq for Illuminaがあり、新しいアッセイをランの計画に利用できます。
| ランセットアップオプション | シーケンスシステム | 検討事項 | リソース |
|---|---|---|---|
| IEM v1.15以降 | すべて | 設置前にシステム要件を確認してください | IEM Software Downloadsページからインストーラーをダウンロードする |
| BaseSpace Sequence Hub Prepタブ | MiniSeq、NextSeqシリーズ | BaseSpace Sequence Hubアカウントへの登録 | BaseSpace.illumina.com。 |
| Local Run Manager装置外 | すべて | 設置前にシステム要件を確認してください | Local Run Manager Software Downloadsページからインストーラをダウンロードします |
140～275 bpのアンプリコンサイズには、2×151 bpペアエンドリードが推奨されます。375 bpアンプリコンサイズでは、MiSeq上で最大2×301 bpのペアエンドランを推奨します。
シーケンスランごとに一緒にプールできる実際のサンプル数は、アンプリコン数とシーケンスカバレッジの望ましい深度によって異なります。これらの計算に役立つオンライン計算機が利用できます。
DNA解析に推奨されるパイプラインは、BaseSpaceのDNA AmpliconアプリとLocal Run Manager DNA Ampliconモジュールです。
Local Run Managerのインストールに関するシステム要件とガイダンスについては、Local Run Managerリファレンスガイドのインストールセクションを参照してください。
AmpliSeq for Illuminaパネルのいくつかは、解析の一環としてCNVコールを実行するように設計されています。BaseSpace Sequence Hubには、CNV解析用の2つのアプリが含まれています。
CNV解析はBaseSpace Sequence Hubでのみ利用できます。
VCF形式は、TruSeq Custom AmpliconまたはAmpliSeq for Illuminaを使用して生成されるかどうかにかかわらず同じです。イルミナのBaseSpace Variant Interpreterは、DNAアンプリコン解析のアノテーション、解釈、フィルタリング解析に使用することができます。
AmpliSeq for Illuminaは新しいマニフェストフォーマットを使用しているため、TruSeq Custom AmpliconマニフェストファイルはAmpliSeq for Illuminaでは再使用できません。カスタムデザインのコンテンツには、対応するマニフェストが利用できるようになります。プレデザインパネルのマニフェストは、イルミナのウェブサイトで入手できます。
次の表に、データ解析オプションを示します。テストデータセットは、AmpliSeq for Illumina Ready-to-Useパネルからのもので、解析ソフトウェアのデモに使用できます。
| 手法 | 説明 | テストデータセット |
|---|---|---|
| DNA Ampliconアプリ | アライメントとバリアントコールの実行に使用されるクラウドベースの解析ソリューション。 | MiniSeq：がんホットスポットv2パネル（NA12878およびHorizonサンプル） |
| Local Run Manager DNA Amplicon解析モジュール | アライメントとバリアントコーリングの実行に使用されるローカル解析ソリューション。 | 現在利用できません |
| OncoCNVトレーナー | アプリは入力コントロールサンプルと対応するパネルベッドファイルを使用して、OncoCNVコーラーアプリが使用するベースラインをトレーニングします。 | OncoCNVトレーナーと発信者のデモ |
| OncoCNVコーラー | アプリは、ノーマライズされたアンプリコンデータを使用して、円形バイナリーセグメンテーションと統計的テストに基づいてコピー数バリアントを検出します。 | OncoCNVトレーナーと発信者のデモ |