TruSeq Custom AmpliconからAmpliSeq for Illuminaへの移行

このリソースは、TruSeq Custom AmpliconからAmpliSeq for Illuminaへの移行プロセスに関する段階的なガイダンスを提供します。

初期検討事項

現在のカスタムアンプリコンパネルの移行

DesignStudioを使用して、AmpliSeq for IlluminaパネルとしてTruSeq Custom Ampliconパネルを再現できます。パネルがLibrary PlusキットおよびAmpliSeq for Illuminaインデックスキットと共に設計および注文されると、パネルはバリデーションランの準備が整います。

パネル設計をサポートするリソース

DesignStudioには、カスタムパネル設計プロセスを進めるためのツールチップとオンラインヘルプが組み込まれています。AmpliSeq for Illumina Custom and Community Panelsサポートページには、ライブラリー調製ユーザーガイド、トレーニングビデオなどの有用な情報が含まれています。さらにサポートが必要な場合は、イルミナテクニカルサポートまたはフィールドアプリケーションサイエンティストにお問い合わせください。

カバレッジの比較可能性

DesignStudioでパネルデザインが完了した後、%のin silicoカバレッジが提供されます。カバレッジ性能の実際の経験的均一性(平均の>0.2倍の割合)は、in silicoカバレッジの数パーセントポイント以内になります。カバレッジの最適化に関するサポートについては、現地のフィールド担当者に連絡してコンシェルジュにお問い合わせください。

互換性のあるサンプルタイプ

AmpliSeq for IlluminaはFFPEから抽出されたDNAと互換性があります。このテクノロジーは、1 ngという低インプットサンプルが可能です。

二本鎖デザインによるFFPEサンプルにおける脱アミノ化アーチファクトの解析

一般的に、シトシンの脱アミノ化によって導入される偽陽性バリアントコール率は極めて低く、AmpliSeq for Illuminaアッセイでは非常に低い頻度(<1%)です。脱アミノ化が大きな懸念事項である場合、UDG酵素製造業者のプロトコールの推奨に従って、FFPE抽出DNAのUDG前処理を行うことができます。

設計のテスト

DesignStudioは、信頼性の高いアンプリコンデザインを返品します。各設計はユニークで、サンプルインプットは異なるため、設計の性能は経験的にテストする必要があります。In silicoデザインカバレッジは、実際のパネル性能の優れた予測因子です。

装置の互換性

これらのパネルは、iSeq 100、MiniSeq、MiSeq、またはNextSeqシリーズシステムでの実行に最適です。

ワークフローに関する考慮事項

必要な機器

TruSeq Custom Amplicon Low InputおよびTruSeq Custom Amplicon v1.5に推奨されるサーマルサイクラーは、AmpliSeq for Illuminaには推奨されません。消耗品と装置リストのサーマルサイクラー、互換性のあるプレート、および磁石の推奨リストを参照してください。

キット構成品

AmpliSeq for Illuminaには、TruSeq Custom Ampliconキットとは異なる試薬キットとインデックスが必要です。必要なコンポーネントの全リストについては、消耗品および機器リストを参照してください。TruSeq Custom Ampliconの要件に関連する以下の違いに注意してください。

以下は別途注文する必要があります。

  • カスタムパネル
  • Library Plusキット
  • インデックスキット

AMPureビーズを購入する必要があります。

注文

注文プロセスはTruSeq Custom Ampliconと同じです。MyIlluminaで注文します。

再注文にはカスタムパネルの新しい合成が必要で、DesignStudioまたはMyIlluminaから注文できます。初回オーダーと再オーダーの違いは、デザインがすでに作成されていることです。再注文と新しいカスタムパネル注文の間でリードタイムに違いはありません。

サンプルQCの推奨

ユーザーガイドに示されているプロトコール修正を使用した低品質の入力は成功しています。市販またはラボで検証されたDNA抽出法は、通常、AmpliSeq for Illuminaアッセイと互換性のあるDNAを生成します。

パネルデザイン

DesignStudioを使用したパネルの設計

TruSeq Custom AmpliconプロジェクトはDesignStudioで再設計する必要があります。TruSeq Custom Ampliconから*.bedファイルにデザインをエクスポートし、AmpliSeq for Illuminaデザインインプットとしてアップロードすることができます。手順については、DesignStudioオンラインヘルプを参照してください。

パネルデザインの作成

パネルを作成する際には、パネルが提供する全体的なカバレッジを評価することが重要です。対象領域が成功したファイルと、設計上のギャップを含むファイルが、カバレッジのない領域のレビューと特定に利用できるようになります。DesignStudioでは、購入を約束することなくパネルを設計できます。

DesignStudioは、パネル設計全体のカバレッジ計算を提供します。また、ギャップファイルをダウンロードして、カバレッジのない領域を特定することもできます。AmpliSeq for Illuminaパネルデザインツールへのアクセスは、イルミナのウェブサイトから入手できます

ライブラリー調製

推奨インプット

推奨入力量はプールあたり10 ngです。許容範囲はプールあたり1~100 ngです。

AmpliSeq for Illuminaは、FFPEサンプルから抽出された低品質のDNAで機能します。低品質サンプルの場合、またはサンプル品質が不明な場合は、増幅ターゲットステップでさらに3回のPCRサイクルを推奨します。AmpliSeq for Illumina Custom and Community PanelsリファレンスガイドのAmplify DNA Targetsセクションにある、温度サイクラープログラムの調整の表を参照してください

ライブラリー調製時間合計

AmpliSeq for Illuminaの総ライブラリー調製時間は5~7時間です。ハンズオン時間は<1.5時間で、ライブラリーの定量化、ノーマライゼーション、プーリングは含まれません。

AmpliSeq for Illumina Index Adapterシーケンス

AmpliSeq for Illuminaプロトコールで使用されるインデックスアダプターは、AmpliSeq for Illumina専用に設計されています。アダプターには独自の設計と修正があります。NexteraまたはTruSeqアダプターはこのプロトコールに対応していません。

アダプターシーケンスについては、イルミナアダプターシーケンスドキュメントのAmpliSeq for Illumina Panelsセクションを、インデックスアダプタープーリングガイドのAmpliSeq for Illuminaプーリングガイドラインセクションを参照してください

ライブラリーのノーマライゼーション、プーリング、ローディング

AmpliSeq for Illuminaライブラリーは、プーリング前にノーマライズしてから、最適なローディング濃度に希釈する必要があります。ガイダンスについては、AmpliSeq for Illumina Custom and Community Panels Reference Guideを参照してください

シーケンス

ランの計画

イルミナのExperiment Manager(IEM)を使用することもできます。IEMは以前のTruSeq Custom Ampliconワークフローでも機能します。BaseSpace Sequence Hub PrepタブとLocal Run ManagerにはAmpliSeq for Illuminaがあり、新しいアッセイをランの計画に利用できます。

セットアップのオプション
ランセットアップオプション シーケンスシステム 検討事項 リソース
IEM v1.15以降 すべて 設置前にシステム要件を確認してください IEM Software Downloadsページからインストーラーをダウンロードする
BaseSpace Sequence Hub Prepタブ MiniSeq、NextSeqシリーズ BaseSpace Sequence Hubアカウントへの登録 BaseSpace.illumina.com
Local Run Manager装置外 すべて 設置前にシステム要件を確認してください Local Run Manager Software Downloadsページからインストーラをダウンロードします
推奨リード長

140~275 bpのアンプリコンサイズには、2×151 bpペアエンドリードが推奨されます。375 bpアンプリコンサイズでは、MiSeq上で最大2×301 bpのペアエンドランを推奨します。

マルチプレックス

シーケンスランごとに一緒にプールできる実際のサンプル数は、アンプリコン数とシーケンスカバレッジの望ましい深度によって異なります。これらの計算に役立つオンライン計算機が利用できます。

データ解析

DNA解析パイプライン

DNA解析に推奨されるパイプラインは、BaseSpaceのDNA AmpliconアプリとLocal Run Manager DNA Ampliconモジュールです。

Local Run Managerのシステム要件

Local Run Managerのインストールに関するシステム要件とガイダンスについては、Local Run Managerリファレンスガイドのインストールセクションを参照してください

CNV解析

AmpliSeq for Illuminaパネルのいくつかは、解析の一環としてCNVコールを実行するように設計されています。BaseSpace Sequence Hubには、CNV解析用の2つのアプリが含まれています。

CNV解析はBaseSpace Sequence Hubでのみ利用できます。

VCFファイルの比較可能性

VCF形式は、TruSeq Custom AmpliconまたはAmpliSeq for Illuminaを使用して生成されるかどうかにかかわらず同じです。イルミナのBaseSpace Variant Interpreterは、DNAアンプリコン解析のアノテーション、解釈、フィルタリング解析に使用することができます。

マニフェストファイルの再利用

AmpliSeq for Illuminaは新しいマニフェストフォーマットを使用しているため、TruSeq Custom AmpliconマニフェストファイルはAmpliSeq for Illuminaでは再使用できません。カスタムデザインのコンテンツには、対応するマニフェストが利用できるようになります。プレデザインパネルのマニフェストは、イルミナのウェブサイトで入手できます

リファレンスデータセット

次の表に、データ解析オプションを示します。テストデータセットは、AmpliSeq for Illumina Ready-to-Useパネルからのもので、解析ソフトウェアのデモに使用できます。

手法 説明 テストデータセット
DNA Ampliconアプリ アライメントとバリアントコールの実行に使用されるクラウドベースの解析ソリューション。 MiniSeq:がんホットスポットv2パネル(NA12878およびHorizonサンプル)
Local Run Manager DNA Amplicon解析モジュール アライメントとバリアントコーリングの実行に使用されるローカル解析ソリューション。 現在利用できません
OncoCNVトレーナー アプリは入力コントロールサンプルと対応するパネルベッドファイルを使用して、OncoCNVコーラーアプリが使用するベースラインをトレーニングします。 OncoCNVトレーナーと発信者のデモ
OncoCNVコーラー アプリは、ノーマライズされたアンプリコンデータを使用して、円形バイナリーセグメンテーションと統計的テストに基づいてコピー数バリアントを検出します。 OncoCNVトレーナーと発信者のデモ

ライブラリー調製のための追加リソース

シーケンスと解析のための追加リソース