NovaSeq 6000システムでのヒト全ゲノムのシーケンス

ワークフローの概要

このページでは、NovaSeq 6000シーケンスシステムでヒト全ゲノムシーケンス（WGS）を実施するための情報と推奨事項を提供します。

ライブラリー調製

TruSeq DNA PCR-Freeライブラリー調製プロトコールは、全ゲノムシーケンスに以下の機能を提供します。

• 低サンプル（LS）および高サンプル（HS）プロトコールは、さまざまな実験に対応します。
• ゲノムカバレッジの質を高め、長いリピート伸長を検出するPCRフリーワークフロー。
• IDT for Illumina-TruSeq Unique Dual（UD）インデックスは別売りです。

TruSeq DNA PCR-Free手順とその他の機能については、 TruSeq DNA PCR-Freeリファレンスガイドを参照してください。

DNAインプット要件

TruSeq DNA PCR-Freeキットには高品質のgDNAが必要です。DNAが劣化すると、ビーズのクリーンアップ中に収率が低下し、サンプルが失われる可能性があります。DNAインプットの推奨、インプットDNAの定量化、DNA品質の評価の詳細については、 TruSeq DNA PCR-Freeリファレンスガイドを参照してください。

サンプルサイズが小さい場合と大きい場合

TruSeq DNA PCR-Freeには、低サンプル（LS）と高サンプル（HS）の両方のサイズに対応するプロトコールが含まれています。LSプロトコールは一度に24のサンプルを処理するために最適化されており、HSプロトコールは一度に96のサンプルを処理するために最適化されています。

各プロトコールおよび消耗品に関する情報については、 TruSeq DNA PCR-Freeリファレンスガイドを参照してください。 

IDT for Illumina – TruSeq UDインデックス

IDT for Illumina-TruSeq UD Indexesは、プレキシシティを高め、正確なリード割り当てとフローセルの効率的な使用を可能にします。IDT for Illumina-TruSeq Indexesは別売りです。プーリングガイドラインについては、インデックスアダプタープーリングガイドを参照してください。インデックスアダプターシーケンスについては、イルミナアダプターシーケンスを参照してください。 

ライブラリー定量

イルミナのシーケンスシステムで高品質のデータを得るには、フローセルのすべてのレーンで最適なクラスター密度が必要です。クラスター密度の最適化には、qPCRを用いたPCRフリーDNAライブラリーの正確な定量が必要です。qPCR以外の方法での定量は不正確である可能性があります。非qPCR法は、両端にアダプターがなくクラスターを形成しない分子を定量化します。PCRエンリッチメントがないため、これらの非クラスター分子の多くが存在する可能性があります。

PCRフリーDNAライブラリーの定量化の詳細については、 TruSeq DNA PCRフリーリファレンスガイドを参照してください。

シーケンスと解析

NovaSeq 6000システムは、全ゲノムシーケンスに以下の機能を提供します。

• NovaSeq 6000は、幅広い出力範囲を持つデュアルフローセルシステムです。
• NovaSeq Xpフローセルドックは、各フローセルの異なるライブラリーのシーケンスを可能にし、ローディング量を減らします。
• パターン化フローセルは、ナノウェル間の間隔を減らし、クラスター密度とデータ出力を向上させます。
• Real-Time Analysis（RTA）は、ラン中にイメージ解析とベースコーリングを実行します。
• シーケンスワークフローはBaseSpace Sequence Hubと統合されています。
• プロジェクトまたはメソッドをレーンで分離します。
• レーン内でマルチプレックスを行い、フローセルあたりのサンプル総数を最大化します。
• NovaSeq 6000システムプロトコールは少ないライブラリーインプットで完了します。

要件

操作および設置要件については、 NovaSeq 6000シーケンスシステム用Site Prepガイドをご覧ください。

調整可能な出力

NovaSeq 6000システムは、1つのフローセルまたは異なる出力を持つ2つのフローセルを同時にシーケンスできます。PCRフリーライブラリー調製を用いた全ゲノムシーケンスでは、インサートサイズが350 bpの2 x 150 bpリード長、またはインサートサイズが550 bpの2 x 250 bpリード長を使用します。全ゲノムシーケンスのサンプルスループットとランタイムの詳細については、NovaSeqシステム仕様を参照してください。

NovaSeq Xpワークフロー

NovaSeq Xpワークフローは、NovaSeq 6000システムの標準オンボードクラスター生成に代わるものです。NovaSeq Xpワークフローでは、以下の追加手順を実行できます。

• プロジェクトまたはメソッドをレーンで分離します。
• レーン内でマルチプレックスを行い、フローセルあたりのサンプル総数を最大化します。
• NovaSeq 6000システムプロトコールは少ないライブラリーインプットで完了します。

プロトコールの詳細については、NovaSeq 6000シーケンスシステムガイドを参照してください。NovaSeq Xpプロトコールの簡易版については、NovaSeq Xpワークフローチェックリストを参照してください。

パターン化フローセルテクノロジー

NovaSeq 6000システムは、パターン化フローセルを使用して密集したクラスターを生成します。パターン化フローセルには、フローセルの両面の固定位置に数十億のナノウェルが含まれています。この構造化された組織では、フローセルがオーバーロードを受けにくく、より幅広いクラスター密度に耐えられるように、均一なシーケンスクラスター間隔を提供します。正確なナノウェルの位置決めにより、クラスターの位置をマッピングする必要がなくなり（テンプレート生成）、シーケンスランの時間を節約できます。クラスター密度が高いほど、フローセルあたりの使用可能なデータ量が増え、シーケンスランのコストを削減できます。

詳細については、 Patterned Flow Cell Technologyウェブページ、Patterned Flow Cell Technologyビデオ、およびPatterned Flow Cell Technologyテクニカルノートを参照してください。

リアルタイム解析

NovaSeq 6000システムはRTA3ソフトウェアを使用して、InterOpファイルとして保存されたラン品質のリアルタイムメトリクスを提供します。InterOpファイルは、タイル、サイクル、リードレベルのメトリクスを含むバイナリ出力です。RTA3の使用方法の詳細については、NovaSeq 6000シーケンスシステムガイドを参照してください。

Sequencing Analysis Viewer

Sequencing Analysis Viewer（SAV）では、RTA3が提供するInterOpファイルからリアルタイムのメトリクスを表示できます。SAVはネットワークコンピューターにインストールして、遠隔地からの実行を監視できます。最新バージョンのダウンロード、ドキュメントへのアクセス、および互換性のある製品の表示については、Sequencing Analysis Viewer を参照してください。

BaseSpace Sequence Hub

Basespace Sequence Hubの全ゲノムシーケンスアプリは、アライメント、バリアントコーリング、アノテーションをサポートするWGSデータ用のツールです。全ゲノムシーケンスアプリの詳細については、BaseSpace Sequence Hub Whole Genome Sequencing Appを参照してください。

解析後、BaseSpace Variant Interpreterを使用して、簡単にアクセスできるアノテーションで生物学的に重要なバリアントを同定できます。小さなバリアントの迅速な解析が優先事項である場合、DRAGEN Germline Pipelineアプリはヒトの全ゲノムを30倍の範囲に約60分で解析します。パイプラインツールとアウトプットの詳細については、DRAGEN BIO-ITプラットフォームを参照してください。

データストレージ

イルミナでは、BaseSpace Sequence Hubにデータをアップロードすることを推奨しています。ランごとの必要な保管に関する情報は、NovaSeq 6000 Sequencing System Site Prep Guideを参照してください。BaseSpace Sequence Hubの設定については、NovaSeq 600シーケンスシステムガイドを参照してください。

ライブラリー調製のための追加リソース

シーケンスと解析のための追加リソース