このリソースでは、iSeq 100システム上でNextera DNA Flex Library Prepに移行するプロセスについて段階的なガイダンスを提供します。
Nextera DNA Flexのライブラリー調製時間の合計は2.5時間です。
Nextera DNA Flex Library Prep時間とTruSeq DNA Nano Library Prep（6時間）およびNextera XT Library Prep（4時間）の比較については、Nextera DNA Flex Library Preparation Kitデータシートを参照してください。
以下のデータシートには、他のイルミナDNAライブラリー調製キットと比較したNextera DNA Flex Library Prepキットに関する情報が記載されています。
Nextera DNA Flex Library PrepおよびiSeq 100 Sequencing Systemを使用したウイルスおよび細菌の全ゲノムシーケンスを含むシーケンス法のガイダンスについては、以下のリソースを参照してください。
サンプルあたりのコストの計算については、お近くの営業担当者にお問い合わせください。
Nextera DNA Flexは以下のサンプルタイプをサポートしています。
Nextera DNA FlexはgDNA（dsDNA）に最適化されており、ssDNA/RNAとはタグメンテーションの基質ではないため互換性がありません。サポートされているサンプルの種類と要件の詳細については、Nextera DNA Flex Library Prep Reference GuideのDNA Input Recommendationsセクション、Nextera DNA Flex Microbial Colony Extraction Demonstrated Protocol Guide（コロニー）、またはNextera Crude Lysate Protocol for Metagenomic Next-Generation Sequencing（糞便サンプル）を参照してください。
PCRアンプリコン>150 bpを入力として使用できます。詳細については、Nextera DNA Flex Library Prep Reference GuideのSample Input Recommendationsセクションを参照してください。
Nextera DNA Flexプロトコールは、1～500 ngのDNAインプットに対応しています。ヒトDNAサンプルやその他の大規模で複雑なゲノムの場合、推奨されるDNAインプットは100～500 ngです。小さなゲノムの場合、DNAインプット量はわずか1 ngまで減らすことができます（それに応じてPCRサイクル条件を変更）。100 < ngのDNAインプットを使用する場合は、最初のDNAサンプルの定量化とノーマライズが必要です。
DNAインプットの推奨の詳細については、Nextera DNA Flex Library Prep Reference GuideおよびNextera DNA Flex FAQを参照してください。
微生物コロニーに関する具体的なガイダンスについては、 Microbial Whole-Genome Sequencing with Nextera DNA Flex Library Preparation Kitアプリケーションノートを参照してください。
100～500 ngのDNAインプットでは、最初のDNAサンプルの正確な定量は不要であり、最終収量のノーマライゼーションが期待されます。
< 100 ng DNAインプットを使用する場合、必要なPCRサイクル数を決定するために最初のDNAサンプルを定量化することが推奨されます。QuantiFluorやPicoGreenなど、蛍光ベースの手法を用いて二本鎖DNAを定量します。
gDNAの濃度は、Qubit dsDNA BR AssayまたはQubit dsDNA HS Assayを使用して決定できます。これらのアッセイでは、RNAよりも二本鎖DNAに高い選択性があり、10 pg/μL～1000 ng/μLの濃度範囲でサンプルを検出できる蛍光色素を使用します。PicoGreen色素は、DNA濃度を正確に測定するためにも使用できます。
詳細については、Nextera DNA Flex Library Prep Reference GuideのDNA Input Recommendationsセクションを参照してください。
Nextera DNA Flex Microbial Colony Extractionの実証済みプロトコールガイドを用いて、以下の項目をテストしました。
DNAサンプル品質の評価に関する情報は、 Nextera DNA FlexリファレンスガイドのDNA純度の評価セクションを参照してください。
Nextera DNA Flexで調製されたさまざまなゲノム（細菌、植物、農業、ヒト）は、BaseSpace Sequence Hubにあります。データはゲノム全体で一貫しています。公開データは、以下のシステムで利用できます。
260 nmの吸光度と280 nmの吸光度の比率は、サンプルの純度を示します。このプロトコールは、純粋なDNAサンプルを示す吸光度比値が1.8～2.0のDNAに最適化されています。この範囲外の値は、不完全なタグメンテーションを引き起こし、最終的なライブラリー収量に悪影響を与える可能性のある汚染物質の存在を示します。ソース、回避、ライブラリーへの影響などの汚染物質の完全なリストについては、Nextera XTトラブルシューティングテクニカルノートを参照してください。
汚染物質によるタグメンテーションが不完全だと、ライブラリー調製の失敗、クラスター化不良、または予想外の足場数の増加につながる可能性があります。
詳細については、 Nextera DNA FlexリファレンスガイドのDNA純度 の評価セクションを参照してください。
Nextera DNA Flex Library Prepキットの使用方法については、以下のリソースを参照してください。
必要なキット、消耗品、および装置の詳細については、Nextera DNA Flex消耗品&装置リストを参照してください。Nextera DNA Flex試薬は、Nextera DNAまたはNextera XT試薬と互換性がありません。
インデックスアダプターとライブラリー調製キットは別売りです。血液サンプルからプロトコールを開始する場合、Flex Lysis Reagentキットも必要です。第三者のインデックスの使用は推奨されません。
Nextera XTキットとNextera DNA Flexキットには、共通する試薬が1つあります。再懸濁バッファー。
Nextera DNA FlexキットとTruSeq DNA Nanoキットの間には、共通する3つの試薬があります。再懸濁バッファー、強化PCRミックス、サンプル精製ビーズ。
詳細については、Nextera DNA Flex Kit Contents 、Nextera XT Kit Contents 、およびTruSeq DNA Nano Kit Contents を参照してください。
Nextera DNA Flex Library Prep Consumables and Equipment Listを参照してください。この情報は、Nextera DNA Flex Library Prep Reference Guideのキット内容セクションでも入手できます。
Fragment Analyzer（Agilent、旧称Advanced Analytical）またはAgilent Technologies 2100 Bioanalyzerを使用して、タグ付きサンプルの品質と目的のサイズ分布を確認します。Bioanalyzerトレースとライブラリーサイズ分布の例については、Nextera DNA Flex Library Prep Reference Guideを参照してください。BioanalyzerプロファイルはインプットDNAタイプに依存するため、変動が予想されます。
詳細については、Nextera DNA Flex Library Prep Reference GuideのCheck Library Qualityセクションを参照してください。以下のビデオリソースも利用できます。
以下のリソースを利用できます。
上記初期検討事項を参照してください。
Nextera DNA Flex Library Prep KitデータシートのNextera DNA Library Prep Performance Tableを参照してください。
Nextera DNA Flexでは、ローディング量は20 μL、ローディング濃度は200 pMです。 ライブラリーは自動的に一本鎖に変性され、装置上でさらに希釈されます。
詳細については、 iSeq 100シーケンスシステムガイドのフローセルとライブラリーおよび クラスター形成の準備 のセクションを参照してください。
このキットは最適化されたNexteraアダプターを使用しています。
詳細については、 Illumina Adapter Sequences Documentの Sequences for Nextera Kitsセクション および Index Adapters Pooling GuideのPooling Guidelines for Nextera Kitsセクションを参照してください。
Nextera DNA Flex Library Prepキットは、ビーズベースのトランスポソーム複合体を使用して、1回の反応ステップでアダプタータグシーケンスを断片化して追加することで、ゲノムDNAにタグを付けます。インプットDNAで飽和すると、ビーズベースのトランスポソーム複合体は一定数のDNA分子を断片化し、幅広いDNAインプット範囲、一貫したタイトな断片サイズ分布、ノーマライズされたライブラリーを使用する柔軟性を提供します。タグメンテーションステップの後、制限サイクルPCRステップにより、Nextera DNA Flexに特異的なインデックスアダプターシーケンスがDNA断片の末端に追加され、イルミナのすべてのシーケンスプラットフォームで機能できるようになります。その後のサンプル精製ビーズ（SPB）のクリーンアップステップでは、イルミナシーケンスシステムで使用するライブラリーを精製します。
詳細については、 Nextera DNA Flex Library PrepリファレンスガイドのNextera DNA Flex Assayの仕組みのセクションを参照してください。
Nextera DNA Flex Microbial Colony Extractionの実証済みプロトコールおよびNextera DNA Flex Library Prep Kitによる直接細菌コロニーシーケンスのアプリケーションノートを参照してください。
アプリケーションノートの以下の文献も役立つ場合があります。
Nextera酵素の性能を低下させる要因には、以下のようなものがあります。
詳細については、Nextera XT Library Prep: ヒントとトラブルシューティング 。
抽出プロトコールの詳細については、 Nextera DNA Flex Microbial Colony Extraction Protocol GuideおよびDirect Bacterial Colony Sequencing with the Nextera DNA Flex Library Prep Kitアプリケーションノートを参照してください。アプリケーションノートには追加のリソースが含まれています。
インデックスは、生体サンプルをラベル付けし、バイオインフォマティクス法を使用してラン中にそれぞれによって生成されたシーケンスデータを区別する方法です。
詳細については、インデックスシーケンス概要ガイド のペアエンドフローセルの デュアル インデックスワークフロー（ワークフローB）セクションを参照してください。
プロトコールにより、一度に1～96個のサンプルを処理できます。ただし、マルチチャネルピペットを用いて8サンプルまたは8の倍数を処理することを推奨します。
実験のためにサンプルプーリングを最適化するには、サンプルゲノムサイズ、希望するカバレッジ、および重複率を知る必要があります。マルチプレックスに関する考慮事項の詳細については、以下のiSeq 100システムセクションのSequencing Nextera DNA FlexのOptimizing Sample Poolingを参照してください。
少数のサンプルのみをプールする場合など、サポートされているインデックスの組み合わせに関する情報については、 インデックスアダプタープーリングガイドの Nexteraプーリングガイドラインセクション または プーリング計算ツールを参照してください。
キット内のインデックスは高純度であり、ライブラリー全体で均一なインデックス表示が得られるように慎重に最適化されているため、他のインデックスを使用することは推奨されません。
詳細については、Illumina Adapter SequencesドキュメントのIllumina Nextera AdaptersセクションおよびIndex Adapters Pooling GuideのNextera Pooling Guidelinesセクションを参照してください。
SPBはサンプル精製ビーズの頭字語で、SPRIは固相可逆固定の頭字語です。この2つの用語は同義語です。イルミナはSPRIの用語からSPBに移行しました。
両面ビーズ精製の目的は、ライブラリー断片のサイズ選択です。2ステップのプロセスでは、まず大きな断片を除去し、2番目のステップでは小さな分子量の断片を除去します。
サンプル精製ビーズサイズの選択とベストプラクティスの詳細については、オンライントレーニングシーケンスコースTruSeq：サンプル精製ビーズサイズの選択とベストプラクティス
ライブラリーのクリーンアップに第三者のサンプル精製ビーズを使用することは推奨されません。第三者のビーズやカラムは、Nextera DNA Flex Library Prepキットと互換性がない場合があります。
GC領域のカバレッジは、使用するサーマルサイクラーのモデル、設定、性能によって影響を受ける可能性があります。イルミナは、Bio-Rad DNA Engine Tetrad 2、Bio-Rad S1000、Bio-Rad C1000、およびMJ Research PTC-225 DNA Engine Tetradサーマルサイクラーを検証しています。他のサーマルサイクラー では性能が異なるため、ゲノムカバレッジに影響を与える可能性があります。
Nextera DNA Flex消耗品&機器リストも参照してください。
Nextera DNA Flexは、Nextera CDインデックスおよびIDT for Illumina Nextera UD Indexキットに対応しています。Nextera XT v2 Indexキットには対応していません。
オンビーズタグメンテーションについては、以下のリソースを参照してください。
以下のリソースを利用できます。
SBSテクノロジーの詳細については、シーケンス：イルミナテクノロジービデオ または次世代シーケンステクノロジーの 紹介を参照してください。
iSeq 100システムにはiSeq 100 i1 Reagentsキットが必要です。必要なユーザー支給の消耗品および装置については、 iSeq 100シーケンスシステムガイドを参照してください。
文書およびトレーニングビデオは、iSeq 100シーケンスシステムサポートページにあります。
iSeq 100シーケンスシステムガイドのシーケンスランのセットアップ（Local Run Managerモード） またはシーケンスランのセットアップ（Manualモード） のセクションを参照してください。
実験のためにサンプルプーリングを最適化するには、サンプルのゲノムサイズ、必要なカバレッジ、および重複率を知る必要があります。Nextera DNA Flexライブラリーの推奨リード長は151サイクルです。シーケンスカバレッジカルキュレーター は、プールできるサンプル数を計算できます。
シーケンスランの計画に関する詳細なガイダンス については、シーケンスカバレッジの 推定テクニカルノートを参照してください。
以下のリソースも利用できます。
最適なシーケンス深度は、実行中のアプリケーションや実験目標によって異なります。該当する参照研究については文献を参照してください。
Nextera DNA CDインデックスを使用する場合は、2x151 bpを推奨します。IDT for Illumina Nextera UD Indexesを使用している場合は、IDT for Illumina Nextera UD Indexesサポートページを参照してください。IDT for Illumina Nextera UD Indexesには10塩基対のインデックスコードが組み込まれており、シーケンスのセットアップに調整が必要な場合があります。
2x250より短いリード長は、リシーケンス時に十分である可能性があります。しかし、de novoアセンブリの場合、ゲノムのアセンブリはより困難になる可能性があります。
iSeq 100シーケンスシステムガイドのシーケンス用ライブラリー調製およびクラスター形成のセクションを参照してください。
Nextera DNA Flexでは、ローディング量は20 μL、ローディング濃度は200 pMです。ライブラリーは自動的に一本鎖に変性され、装置上でさらに希釈されます。
詳細については、 iSeq 100シーケンスシステムガイドのフローセルとライブラリーおよび クラスター形成の準備 のセクションを参照してください。
PhiX Control v3 Libraryとは何か、イルミナNGSにおける機能は何か、技術資料をご覧ください。
iSeq 100シーケンスシステムガイドのリードのサイクル 数セクションを参照してください。
ペアエンドシーケンスでは、断片の両端をシーケンスし、高品質でアライメント可能なシーケンスデータを生成できます。ペアエンドシーケンスは、ゲノム再構成や反復配列要素、遺伝子融合や新規転写産物の検出を容易にします。
ペアエンドリードはリファレンスにアライメントされる可能性が高いため、データセット全体の品質が向上します。イルミナの次世代シーケンス（NGS）システムはすべてペアエンドシーケンスが可能です。
シングルリードシーケンスでは、一端のみからDNAをシーケンスし、イルミナシーケンスを使用する最もシンプルな方法です。このソリューションは、独自の可逆的ターミネーターケミストリーと新規ポリメラーゼを使用することで、大量の高品質データを迅速かつ経済的にお届けします。
詳細については、 Indexed Sequencing Overview Guide の Illuminaウェブサイトおよび Dual-Indexed Workflow on a Paired-End Flow Cell（Workflow B）セクションを参照してください。
イルミナシステムのクラスター最適化概要ガイド および クラスター密度ガイドラインを参照してください。
パターン化フローセルには、フローセルの両面の固定位置に数十億のナノウェルが含まれています。構造化された組織により、シーケンスクラスターの間隔が均等になります。
詳細については、 Patterned Flow Cell Technology ウェブページ、 ビデオ、および テクニカルノートを参照してください。
イルミナのシーケンスデータの解析 に使用される概念と一般的なアプローチに関する入門プレゼンテーションとディスカッションについては、シーケンスデータ解析における主要概念の紹介ウェビナーを参照してください。このウェビナーはイルミナのNGSユーザーを対象としており、de novoアセンブリ、RNAシーケンス、SNP発見で使用される基本的な解析アプローチをカバーしています。実験計画における基本的な概念についても考察します。
解析にLocal Run Managerを使用する場合、機器およびコンピューティング要件は Local Run Managerソフトウェアガイドのインストールセクションに記載されています。
以下のデータが利用可能です。
Direct Bacterial Colony SequencingとNextera DNA Flex Library Prep Kitアプリケーションノートのde novoアセンブリメトリクスの比較セクションを参照してください。
カバレッジプロットから、直接コロニー法を含むNextera DNA Flex法は、どの生物を検査するか、またはGC含有量かにかかわらず、Nextera XT DNA法と比較して、カバレッジの均一性が高いことがわかります。
詳細については、 Direct Bacterial Colony SequencingとNextera DNA Flex Library Prep Kit アプリケーションノートの全ゲノムカバレッジの比較セクションを参照してください。
iSeq 100システムサンプルシートテンプレートを使用してサンプルシート を作成できます。BaseSpace Sequence Hub Run Monitoring and Storageで手動モードでシーケンスする場合、サンプルシートが必要です。サンプルシートをダウンロードして編集し、ランセットアップ中にコントロールソフトウェアにアップロードします。
ランセットアップの概要については、 iSeq 100シーケンスシステムガイドのシーケンスランのセットアップ（Local Run Manager Mode） またはシーケンスランのセットアップ（Manual Mode）のセクションを参照してください。
イルミナアダプター シーケンスドキュメントのNexteraキットのシーケンスセクション および インデックスアダプタープーリングガイドのNexteraキットのプーリングガイドラインセクションを参照してください。
良好なインデックス表現は、各ライブラリーが他のライブラリーと一緒にマルチプレックスされると、フローセル上のカバレッジのほぼ等しい表現を受け取ることを示しています。これは、特定の実験の結果をより均一にカバーし、精度を高めることを意味します。
詳細については、 Direct Bacterial Colony Sequencing With the Nextera DNA Flex Library Prep Kitアプリケーションノートのインデックス表示とライブラリーインサートサイズ比較セクションを参照してください。
Local Run Managerは、イルミナのベンチトップシーケンスデータ用のWindowsベースのソフトウェアで、ローカル解析オプションとランおよびユーザー管理が含まれます。 Local Run Managerウェビナー では、Local Run Managerの概要を説明し、新規および中間ユーザーを対象としています。詳細については、 Local Run Managerサポートページ および Local Run Manager概要オンライントレーニングコースを参照してください。
Local Run Managerのセットアップについては、 シーケンスファイルフォーマット、 FASTQデータ解析用処理ツールウェビナー、 Local Run Manager導入ウェビナーを参照してください。
インストールの最小システム要件については、 Local Run Managerソフトウェアガイドのインストールセクションを参照してください。
BaseSpace Sequence Hubは、イルミナのクラウドベースのシーケンスデータ解析ソリューションです。ランとプロジェクトの違い、データの取り扱い、データの共有などのトピックの詳細については、 BaseSpace Sequence Hubウェビナーを参照してください。BaseSpace Sequence Hubの使用の詳細については、 BaseSpace Sequence Hubサポートページ とBaseSpace Sequence Hubによるラン の準備 トレーニングコースを参照してください。
以下のリソースを参照してください。
以下の解析アプリが利用可能です。
微生物シーケンス（分離株用）：
サードパーティのツール/ソフトウェア（微生物学/分離）：
| リソース | 説明 |
|---|---|
| Nextera DNA Flex Library Prepリファレンスガイド | 詳細なプロトコールを含む、Nextera DNA Flexライブラリー調製に関する包括的な情報を提供します。 |
| Nextera DNA Flex Library Prep消耗品&機器リスト | Nextera DNA Flex Library Prepキットで使用する消耗品と機器のインタラクティブなリスト。 |
| インデックスアダプタープーリングガイド | イルミナシステムにおけるシーケンスのためのバランスの取れたインデックスの組み合わせによるライブラリー調製のガイドラインを提供します。 |
| イルミナアダプターシーケンス文書 | Nextera、TruSeq、TruSight、AmpliSeq for Illuminaライブラリー調製キットで使用されるイルミナアダプターのオリゴヌクレオチド（オリゴ）シーケンス。この情報はイルミナの機器との使用に限定して提供されています。 |
| Nextera DNA Flex Library Prepサポートページ | 文書、トレーニングリソース、よくある質問、および互換性のあるイルミナ製品に関する情報を提供します。 |
| リソース | 説明 |
|---|---|
| iSeq 100シーケンスシステムガイド | iSeq 100シーケンスシステムの操作とメンテナンスのシステム概要と手順について説明します。 |
| iSeq 100シーケンスシステムセットアップポスター | iSeq 100シーケンスシステムの設置とセットアップの手順 |
| iSeq 100シーケンスシステムサイト調製ガイド | iSeq 100シーケンスシステム用のサイトを準備するためのラボ仕様と要件を提供します。 |
| Local Run Managerソフトウェアガイド | Local Run Managerソフトウェアの概要と装置コンピューターへの解析モジュールのインストール手順。 |
| iSeq 100シーケンスシステムサポートページ | 文書、トレーニングリソース、よくある質問、および互換性のあるイルミナ製品に関する情報を提供します。 |